大球盖菇菌种生产方法和蘑菇、草菇菌种生产方法基本相同，可用组织分离法和孢子分离法获得纯菌种，新区主要靠引进母种或原种。适合大球盖菇母种生产的培养基如下：

　　一、母种培养基

　　1、麦芽糖酵母琼脂培养基(MYA)大豆蛋白胨(豆胨)1克、酵母2克、麦芽糖20克、琼脂20克，加水至1000毫升。

　　2、马铃薯葡萄糖酵母琼脂培养基(PDYA)马铃薯300克(加水1500毫升，煮20分钟，用滤汁)、酵母2克、豆胨1克、葡萄糖10克、琼脂20克，加水至1000毫升。

　　3、燕麦粉麦芽糖酵母琼脂培养基(DMYA)燕麦粉80克、麦芽糖10克、酵母2克、琼脂20克，加水至1000毫升。

　　上述3种配方中如不加琼脂，即可作为液体培养基。以上培养基需按常规配制、分装、灭菌、接种和培养。

　　二、原种和栽培种培养基

　　1、小麦秆或裸麦秆，切碎(长23厘米)，泡湿，装瓶，高压灭菌后备用。

　　2、小麦、裸麦，高粱、玉米、小米等谷粒浸泡，煮透至没有白芯但表皮不破，加2%碳酸钙，装瓶，高压灭菌后备用。

　　3、木屑和小木片各40%、麸皮20%，制作栽培种培养基。

　　还可用平菇或金针菇下脚料作培养基重新灭菌后备用。

　　三、接种

　　可以用培养34天的液体菌种接种。若用固体菌种必须加大接种量(菌种/培养料)，接种量最少10%，最好15%20%。

　　四、培养

　　接种后，把菌种瓶或袋放在2028℃培养室中培养。大球盖菇菌丝生长几天后，菌丝生长速度会逐渐缓慢，加速菌丝生长的方法是搅拌。用液体菌种接种的无菌麦粒培养基，每隔37天摇瓶一次，把菌丝摇断，可以刺激菌丝再生，能保证菌丝生长旺盛。